研究背景 >>

膿毒癥是導(dǎo)致疾病和死亡的主要原因，快速的病原體鑒定和微生物藥敏性表型分析對(duì)于選擇治療方案和確保病患安全至關(guān)重要。目前的病原體鑒定和基于培養(yǎng)的藥敏試驗(yàn)（Antimicrobial Susceptibility testing，AST）可能需要三天或更長(zhǎng)時(shí)間，在本研究中，研究者旨在確定牛津納米孔（Oxford Nanopore Technologies，ONT）測(cè)序是否可以在保證診斷性能的前提下減少臨床報(bào)告的生成周期。

研究方法 >>

整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示，實(shí)驗(yàn)選取的研究對(duì)象是以膿毒癥為臨床特征的已入住重癥監(jiān)護(hù)室的兒童和成人。首先是去除宿主基因組DNA；然后進(jìn)一步提取微生物gDNA，隨后是DNA質(zhì)量和純度檢查。使用ONT基因組DNA連接試劑盒制備文庫(kù)，并在MinION MK1B設(shè)備上運(yùn)行，測(cè)序過(guò)程使用MinKNOW檢測(cè)。文庫(kù)運(yùn)行72小時(shí)，但大多數(shù)樣本在6-12小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生了足夠的數(shù)據(jù)以供進(jìn)一步分析，使用PycoQC進(jìn)行QC分析。此外，從陽(yáng)性血培（BC）菌液中分離的純菌落也進(jìn)行了全基因組測(cè)序，整個(gè)測(cè)序過(guò)程在Illumina MiniSeq平臺(tái)上進(jìn)行。

圖1：Nanopore測(cè)序和陽(yáng)性BC常規(guī)分析工作流程

數(shù)據(jù)分析和處理 >>

原始下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Nanofilt進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，使用Minimap2對(duì)其進(jìn)行了與參考基因組GRCh38的比對(duì)，以去除宿主基因組reads，使用Kraken2進(jìn)行了分類學(xué)分配。同時(shí)將過(guò)濾下來(lái)的數(shù)據(jù)使用flye v2.9進(jìn)行組裝，使用參數(shù)“—nano-raw –meta –iterations 3”。使用MaxBin v2.2.7和MetaBAT v2.15來(lái)執(zhí)行宏基因組分箱操作，然后使用DAS Tool v1.1.5來(lái)將不同宏基因組分箱后得到的bins進(jìn)行整合，以提高對(duì)高質(zhì)量未分箱contigs中特定抗微生物耐藥性(Anti-microbial Resistance, AMR)基因的保留率?；蚪M組裝完成后使用Checkm2來(lái)進(jìn)行后續(xù)評(píng)估，組裝結(jié)果上傳到AREScloud進(jìn)行藥物敏感性預(yù)測(cè)。最后使用基于ARESdb訓(xùn)練的堆疊分類機(jī)器學(xué)習(xí)來(lái)預(yù)測(cè)AST模型，同時(shí)結(jié)合抗性預(yù)測(cè)的規(guī)則，通過(guò)ResFinder4執(zhí)行物種特異性的敏感性和耐藥性預(yù)測(cè)。作為參考，研究者還將來(lái)自BC的ONT測(cè)序耐藥基因分型與通過(guò)Illumina測(cè)序的純培養(yǎng)分離物進(jìn)行比較，來(lái)確定體外耐藥基因的基因型，并比較樣本類型中AMR基因的存在/缺失情況的一致性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 >>

血培養(yǎng)微生物鑒定

整個(gè)實(shí)驗(yàn)一共使用了來(lái)自201名患者的66份陽(yáng)性血液樣本，排除非細(xì)菌生長(zhǎng)、缺失樣本和外源污染物后，剩下52份用于測(cè)序分析，鑒定后分為27種革蘭氏陽(yáng)性菌和23種革蘭氏陰性菌樣本，以及2份多菌樣本（表1）。

表1：常規(guī)血液培養(yǎng)后的物種鑒定

測(cè)序樣本分類學(xué)鑒定和體外AST預(yù)測(cè)

排除污染物、厭氧生物以及存在多菌的樣本之后，剩下42個(gè)樣本進(jìn)行了AST預(yù)測(cè)和AST表型比較。針對(duì)其中具有高質(zhì)量AREScloud預(yù)測(cè)結(jié)果的24個(gè)樣本，進(jìn)行了262次AST預(yù)測(cè)，總體分類一致性（Categorical Agreement，CA）為89.3%，但極重大誤差率（Very Major Error, VME）為12.1%，重大誤差率(Major Error, ME)為10.5%（表2）。對(duì)于總體42個(gè)樣本的所有470個(gè)AST預(yù)測(cè)，總體CA為87.7%，VME為28.4%，ME為8.3%（表3）。通過(guò)比較常規(guī)培養(yǎng)與測(cè)序分析兩個(gè)方法，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)樣本在屬水平上一致，但測(cè)序在分類學(xué)鑒定上更為準(zhǔn)確。

表2：ONT與常規(guī)培養(yǎng)illumina測(cè)序的預(yù)測(cè)AST表現(xiàn)（高質(zhì)量樣本）

表3：ONT與常規(guī)培養(yǎng)基illumina測(cè)序的預(yù)測(cè)AST表現(xiàn)（所有樣本）

ONT和illumina測(cè)序結(jié)果分析

比較基于血培養(yǎng)分離的ONT測(cè)序結(jié)果和基于純培養(yǎng)分離的illumina測(cè)序結(jié)果的熱圖（見(jiàn)圖2），發(fā)現(xiàn)兩者AMR基因上出現(xiàn)了一些差異。基于illumina的純分離物測(cè)序檢測(cè)到了額外的AMR基因靶點(diǎn)。在單細(xì)菌的樣本中，ONT技術(shù)檢測(cè)到的AMR基因靶點(diǎn)比illumina多一個(gè)。

圖2：ONT測(cè)序和illumina測(cè)序AMR基因熱圖比較

縱軸樣本后綴“PC”表示illumina測(cè)序，“BC”表示ONT測(cè)序

報(bào)告周期

統(tǒng)計(jì)基于BC進(jìn)行ONT測(cè)序的整個(gè)報(bào)告周期時(shí)間來(lái)看，測(cè)序前處理步驟需約4小時(shí)；對(duì)于單個(gè)樣本，芯片運(yùn)行約12小時(shí)；AREScloud的AST測(cè)試過(guò)程約1小時(shí)，整個(gè)路程在9-17小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)，比常規(guī)AST測(cè)試方法和基于 illumina的方法（長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)或更長(zhǎng)）更快。

結(jié)論 >>

目前臨床應(yīng)用上有幾種快速分子診斷試劑可用于物種鑒定和耐藥基因檢測(cè)（例如，BCID2，eplex，VERIGENE，T2MR等），但這些試劑通常限制了相對(duì)有限數(shù)量的物種和目的耐藥基因?；跍y(cè)序的方法的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)不僅在于可以檢測(cè)樣本中潛在的任何細(xì)菌，還能提供多種抗生素的預(yù)測(cè)表型，方便選擇適當(dāng)?shù)闹委煼桨?，可以最大限度的提高臨床效用。

本研究證實(shí)陽(yáng)性BC液直接測(cè)序是可行的，可以提供準(zhǔn)確的病原微生物物種水平鑒定，基于ONT測(cè)序的方法可能更快，但由于本研究中常見(jiàn)菌群出現(xiàn)MEs/VMEs比例較大的情況，在考慮臨床應(yīng)用之前仍有很長(zhǎng)一段距離。