研究背景 >>

膿毒癥是導(dǎo)致疾病和死亡的主要原因，快速的病原體鑒定和微生物藥敏性表型分析對于選擇治療方案和確保病患安全至關(guān)重要。目前的病原體鑒定和基于培養(yǎng)的藥敏試驗（Antimicrobial Susceptibility testing，AST）可能需要三天或更長時間，在本研究中，研究者旨在確定牛津納米孔（Oxford Nanopore Technologies，ONT）測序是否可以在保證診斷性能的前提下減少臨床報告的生成周期。

研究方法 >>

整個實驗流程如圖1所示，實驗選取的研究對象是以膿毒癥為臨床特征的已入住重癥監(jiān)護室的兒童和成人。首先是去除宿主基因組DNA；然后進一步提取微生物gDNA，隨后是DNA質(zhì)量和純度檢查。使用ONT基因組DNA連接試劑盒制備文庫，并在MinION MK1B設(shè)備上運行，測序過程使用MinKNOW檢測。文庫運行72小時，但大多數(shù)樣本在6-12小時內(nèi)產(chǎn)生了足夠的數(shù)據(jù)以供進一步分析，使用PycoQC進行QC分析。此外，從陽性血培（BC）菌液中分離的純菌落也進行了全基因組測序，整個測序過程在Illumina MiniSeq平臺上進行。

圖1：Nanopore測序和陽性BC常規(guī)分析工作流程

數(shù)據(jù)分析和處理 >>

原始下機數(shù)據(jù)經(jīng)過Nanofilt進行質(zhì)量過濾，使用Minimap2對其進行了與參考基因組GRCh38的比對，以去除宿主基因組reads，使用Kraken2進行了分類學分配。同時將過濾下來的數(shù)據(jù)使用flye v2.9進行組裝，使用參數(shù)“—nano-raw –meta –iterations 3”。使用MaxBin v2.2.7和MetaBAT v2.15來執(zhí)行宏基因組分箱操作，然后使用DAS Tool v1.1.5來將不同宏基因組分箱后得到的bins進行整合，以提高對高質(zhì)量未分箱contigs中特定抗微生物耐藥性(Anti-microbial Resistance, AMR)基因的保留率?；蚪M組裝完成后使用Checkm2來進行后續(xù)評估，組裝結(jié)果上傳到AREScloud進行藥物敏感性預(yù)測。最后使用基于ARESdb訓練的堆疊分類機器學習來預(yù)測AST模型，同時結(jié)合抗性預(yù)測的規(guī)則，通過ResFinder4執(zhí)行物種特異性的敏感性和耐藥性預(yù)測。作為參考，研究者還將來自BC的ONT測序耐藥基因分型與通過Illumina測序的純培養(yǎng)分離物進行比較，來確定體外耐藥基因的基因型，并比較樣本類型中AMR基因的存在/缺失情況的一致性。

實驗結(jié)果 >>

血培養(yǎng)微生物鑒定

整個實驗一共使用了來自201名患者的66份陽性血液樣本，排除非細菌生長、缺失樣本和外源污染物后，剩下52份用于測序分析，鑒定后分為27種革蘭氏陽性菌和23種革蘭氏陰性菌樣本，以及2份多菌樣本（表1）。

表1：常規(guī)血液培養(yǎng)后的物種鑒定

測序樣本分類學鑒定和體外AST預(yù)測

排除污染物、厭氧生物以及存在多菌的樣本之后，剩下42個樣本進行了AST預(yù)測和AST表型比較。針對其中具有高質(zhì)量AREScloud預(yù)測結(jié)果的24個樣本，進行了262次AST預(yù)測，總體分類一致性（Categorical Agreement，CA）為89.3%，但極重大誤差率（Very Major Error, VME）為12.1%，重大誤差率(Major Error, ME)為10.5%（表2）。對于總體42個樣本的所有470個AST預(yù)測，總體CA為87.7%，VME為28.4%，ME為8.3%（表3）。通過比較常規(guī)培養(yǎng)與測序分析兩個方法，發(fā)現(xiàn)兩個樣本在屬水平上一致，但測序在分類學鑒定上更為準確。

表2：ONT與常規(guī)培養(yǎng)illumina測序的預(yù)測AST表現(xiàn)（高質(zhì)量樣本）

表3：ONT與常規(guī)培養(yǎng)基illumina測序的預(yù)測AST表現(xiàn)（所有樣本）

ONT和illumina測序結(jié)果分析

比較基于血培養(yǎng)分離的ONT測序結(jié)果和基于純培養(yǎng)分離的illumina測序結(jié)果的熱圖（見圖2），發(fā)現(xiàn)兩者AMR基因上出現(xiàn)了一些差異。基于illumina的純分離物測序檢測到了額外的AMR基因靶點。在單細菌的樣本中，ONT技術(shù)檢測到的AMR基因靶點比illumina多一個。

圖2：ONT測序和illumina測序AMR基因熱圖比較

縱軸樣本后綴“PC”表示illumina測序，“BC”表示ONT測序

報告周期

統(tǒng)計基于BC進行ONT測序的整個報告周期時間來看，測序前處理步驟需約4小時；對于單個樣本，芯片運行約12小時；AREScloud的AST測試過程約1小時，整個路程在9-17小時內(nèi)實現(xiàn)，比常規(guī)AST測試方法和基于 illumina的方法（長達48小時或更長）更快。

結(jié)論 >>

目前臨床應(yīng)用上有幾種快速分子診斷試劑可用于物種鑒定和耐藥基因檢測（例如，BCID2，eplex，VERIGENE，T2MR等），但這些試劑通常限制了相對有限數(shù)量的物種和目的耐藥基因?；跍y序的方法的一個關(guān)鍵優(yōu)勢不僅在于可以檢測樣本中潛在的任何細菌，還能提供多種抗生素的預(yù)測表型，方便選擇適當?shù)闹委煼桨?，可以最大限度的提高臨床效用。

本研究證實陽性BC液直接測序是可行的，可以提供準確的病原微生物物種水平鑒定，基于ONT測序的方法可能更快，但由于本研究中常見菌群出現(xiàn)MEs/VMEs比例較大的情況，在考慮臨床應(yīng)用之前仍有很長一段距離。