Actin變異系數(shù)高達(dá)47%!還能用作中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)參嗎?

來源: | 作者:/ | 發(fā)布時(shí)間: 2025-03-13 | 224 次瀏覽 | 分享到:

以下內(nèi)容來源于伯樂生命科學(xué)：

Western Blot 實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參蛋白的選擇可謂至關(guān)重要：控制上樣量，確保各個(gè)樣本上樣量一致，確保數(shù)據(jù)的可靠性與準(zhǔn)確度。然而，在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中具備內(nèi)參蛋白特征的選擇很少，包括常用的管家蛋白（actin、tubulin、GAPDH等）。

澳大利亞精神病學(xué)實(shí)驗(yàn)室Brian Dean教授認(rèn)為很難找到在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的基因符合內(nèi)參所要求的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。可能的原因是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)由多種細(xì)胞類型組成，在不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域以不同的組合存在，管家蛋白表達(dá)會(huì)受到細(xì)胞類型差異的顯著影響，難以保持穩(wěn)定，因此作為內(nèi)參的可靠性大打折扣。此外，疾病病理狀態(tài)也會(huì)影響管家蛋白表達(dá)，病理過程可能包括神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)、代謝改變或基因調(diào)控異常等因素。

為確認(rèn)β-actin是否適合作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)樣品Western Blot實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參，Brian Dean教授研究小組開展了一項(xiàng)系統(tǒng)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-actin在皮質(zhì)中的變異系數(shù)高達(dá)47%！這一結(jié)果基本上說明了β-actin可能不適合在相應(yīng)樣品中作為內(nèi)參使用（參考文獻(xiàn)1）。這是一項(xiàng)極具價(jià)值的系統(tǒng)性研究，他們使用 194 名患有或未患有精神疾病的受試者大腦樣品，對(duì)其布羅德曼區(qū) 9（BA9）中常用內(nèi)參蛋白 β-actin 的水平進(jìn)行了細(xì)致檢測(cè) 。

布羅德曼區(qū) 9 位于背外側(cè)前額葉皮層內(nèi)，該區(qū)域被認(rèn)為受精神分裂癥和情緒障礙等疾病的病理生理學(xué)影響，因此選擇這一區(qū)域進(jìn)行研究，有助于清晰地了解常用管家蛋白是否會(huì)隨病理生理學(xué)變化而改變。在樣本選取上，研究小組全面考量了多種因素，涵蓋了不同性別、年齡、精神疾病狀態(tài)的人群，其中男性 136 名，女性 58 名，平均年齡為 49 歲。這些受試者包含 70 名沒有精神或神經(jīng)障礙病史的健康者、75 名精神分裂癥患者、24 名重度抑郁癥患者、17 名雙相情感障礙患者和 8 名沒有可識(shí)別精神病的自殺者，確保了樣本的多樣性和代表性。

重要的研究結(jié)論包括：

Actin 水平高變異：跨病例樣本的 β-actin 信號(hào)總強(qiáng)度范圍呈現(xiàn)出極大的跨度，從 212 至 4,461 不等，變異系數(shù)高達(dá) 47% ！這一數(shù)據(jù)直觀地表明，β-actin 在不同個(gè)體中的表達(dá)水平存在著顯著的差異，其穩(wěn)定性遠(yuǎn)不能滿足內(nèi)參蛋白的嚴(yán)格要求。β-actin 如此高的變異系數(shù)，無疑使其作為中樞神經(jīng)系統(tǒng) WB 實(shí)驗(yàn)內(nèi)參的可靠性大打折扣，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解讀產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。
與總蛋白比例不恒定：β-actin 在人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與組織總蛋白的比例并不恒定，β-actin 水平并未反映起始總蛋白濃度。內(nèi)參蛋白的一個(gè)重要特性是與組織總蛋白保持恒定的比例關(guān)系，這樣才能在實(shí)驗(yàn)中準(zhǔn)確地校正目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。進(jìn)一步證明了其不適合作為中樞神經(jīng)系統(tǒng) WB 實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參。
與其他因素的相關(guān)性：β-actin 的信號(hào)強(qiáng)度與年齡、中樞神經(jīng) pH、PMI（死后間隔時(shí)間）、中樞神經(jīng)重量、病期（DI）等均沒有顯著相關(guān)性。雖然從表面上看，這似乎符合內(nèi)參蛋白不受這些因素影響的特點(diǎn)，但結(jié)合其表達(dá)水平的高變異系數(shù)以及與總蛋白比例的不恒定，這種 “不相關(guān)性” 并不能說明 β-actin 適合作為內(nèi)參。因?yàn)閮?nèi)參蛋白不僅要不受這些因素的影響，更重要的是要在不同樣本中保持穩(wěn)定的表達(dá)和與總蛋白恒定的比例關(guān)系。而 β-actin 在其他關(guān)鍵方面的不足，使得它難以滿足內(nèi)參蛋白的綜合要求，無法為中樞神經(jīng)系統(tǒng) WB 實(shí)驗(yàn)提供可靠的參照。

Brian Dean教授研究組發(fā)現(xiàn)Ponceau S染色的總蛋白比β-actin作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)WB內(nèi)參具有更低的變異系數(shù)（24~27%），強(qiáng)烈建議相關(guān)研究使用總蛋白染色內(nèi)參。但Ponceau S染色因靈敏度相對(duì)較低、染色結(jié)果不穩(wěn)定、背景干擾、顏色區(qū)分度欠佳等缺點(diǎn)，也會(huì)為實(shí)驗(yàn)者帶來一定的使用不便。

匹茲堡大學(xué)Divay Chandra實(shí)驗(yàn)室研究了幾種不同的Western Blot總蛋白染色方法的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，以及這些方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，包括Ponceau S和Stain-Free（Bio-Rad免染）方法。其關(guān)鍵結(jié)論如下（參考文獻(xiàn)2）：

準(zhǔn)確性：

Stain-Free 方法在不同類型的膜和蛋白載量下都能保持高準(zhǔn)確性，而 Ponceau S 的準(zhǔn)確性受膜類型和蛋白載量的影響較大。

精確度：

Stain-Free 方法的精確度高于 Ponceau S，能夠減少數(shù)據(jù)中的技術(shù)變異性，從而提高結(jié)果的可重復(fù)性。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

使用 Stain-Free 方法可以顯著減少獲得有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義結(jié)果所需的樣本數(shù)量，這對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和資源利用具有重要意義。

論文指出，盡管 Ponceau S 是一種常用的總蛋白歸一化方法，但其在不同膜類型和蛋白載量下的表現(xiàn)不夠穩(wěn)定，尤其是在 PVDF 膜上。相比之下，Stain-Free 方法在各種條件下都能保持高準(zhǔn)確性和精確度，因此在 Western 印跡實(shí)驗(yàn)中，推薦優(yōu)先使用 Stain-Free 方法進(jìn)行總蛋白歸一化。這不僅提高了數(shù)據(jù)的可信度，還減少了實(shí)驗(yàn)所需的樣本量，提高了實(shí)驗(yàn)效率。

圖源：參考文獻(xiàn)2

Stain-Free免染技術(shù)是一種Bio-Rad開發(fā)的用于Western Blot實(shí)驗(yàn)中的總蛋白歸一化方法，它通過在凝膠中加入特殊的化學(xué)試劑，能夠在電泳后中直接檢測(cè)凝膠中或膜上的蛋白質(zhì)，而無需額外的染色步驟。Stain-Free技術(shù)特別適用于需要高準(zhǔn)確性和精確度的Western印跡實(shí)驗(yàn)，尤其是在處理不同類型的膜和蛋白上樣量時(shí)。

參

考

文

獻(xiàn)

1.Parkin GM, Udawela M, Gibbons A, Dean B. Β-actin does not show the characteristics of a reference protein in human cortex. Electrophoresis. 2019 Jan;40(2):247-253. doi: 10.1002/elps.201800328. Epub 2018 Nov 6. PMID: 30367480.
2.Maloy A, Alexander S, Andreas A, Nyunoya T, Chandra D. Stain-Free total-protein normalization enhances the reproducibility of Western blot data.

Anal Biochem. 2022 Oct 1;654:114840. doi: 10.1016/j.ab.2022.114840. Epub 2022 Aug 2. PMID: 35931182; PMCID: PMC10214384.

* BIO-RAD 是 BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定區(qū)域的商標(biāo)。

* 本產(chǎn)品僅用于科研用途，不用于臨床診斷。

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