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生信篇 | Unicycler實(shí)戰(zhàn)指南：駕馭二代與三代測(cè)序組裝全流程

來(lái)源: | 作者:/ | 發(fā)布時(shí)間: 2025-04-21 | 935 次瀏覽 | 分享到:

Unicycler是專為細(xì)菌基因組設(shè)計(jì)的組裝工具，既支持純二代(Illumina)或純?nèi)?Nanopore/PacBio)數(shù)據(jù)，也擅長(zhǎng)混合組裝。它融合了 De Bruijn 圖（適用于短讀段）和字符串圖（String Graph，適用于長(zhǎng)讀段）兩種策略，兼顧準(zhǔn)確性與連續(xù)性。上一期我們?cè)敿?xì)介紹了Unicycler在混合組裝中的應(yīng)用，這期我們將帶來(lái)Unicycler單獨(dú)進(jìn)行二代與三代組裝的應(yīng)用。

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Unicycler工作原理詳解


二代數(shù)據(jù)組裝流程

  • 圖構(gòu)建：拆分短序列為k-mer（默認(rèn)k=21/33/55），構(gòu)建 De Bruijn 圖，通過(guò)尋找歐拉路徑生成初步contig；

  • 糾錯(cuò)優(yōu)化：借助 SPAdes 算法改良，結(jié)合橋接(bridging)與覆蓋過(guò)濾，解決重復(fù)區(qū)段問(wèn)題，提高組裝連貫性。


三代數(shù)據(jù)組裝流程

  • 初步組裝：基于 Miniasm 快速構(gòu)建重疊圖；

  • 多輪校正：默認(rèn)結(jié)合 Racon 進(jìn)行3輪錯(cuò)誤校正；

  • 自動(dòng)閉環(huán)：識(shí)別染色質(zhì)/質(zhì)粒環(huán)狀結(jié)構(gòu)，輸出完整閉環(huán)序列。

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操作流程與參數(shù)解析


數(shù)據(jù)準(zhǔn)備要求

  • 二代數(shù)據(jù)：雙端FASTQ文件，推薦覆蓋度≥50x；

  • 三代數(shù)據(jù)：FASTQ/FASTA格式，推薦N50≥10kb，覆蓋度≥30x。


常用命令示例

場(chǎng)景一：僅用二代數(shù)據(jù)組裝

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  • --mode：組裝模式（normal/bold/conservative）；

  • --min_fasta_length：設(shè)定輸出Contig的最小長(zhǎng)度。

場(chǎng)景二：僅用三代數(shù)據(jù)組裝

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  • --keep：保留中間文件，便于后續(xù)調(diào)試與評(píng)估；

  • –min_polish_size：只對(duì) ≥10 kb 的contig進(jìn)行拋光。

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實(shí)戰(zhàn)演練：E.coli基因組組裝


數(shù)據(jù)信息

  • 樣本：大腸桿菌E.coli K-12，基因組大小約4.6Mb；

  • 測(cè)序平臺(tái)：

二代：Illumina NovaSeq PE150，覆蓋度100x；

三代：Nanopore PromethION，N50=15 kb，覆蓋度50x。


運(yùn)行示例

二代數(shù)據(jù)：

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輸出文件：

assembly.fasta：最終組裝序列（含環(huán)化信息）；

assembly.gfa：組裝圖文件，可用Bandage可視化。

三代數(shù)據(jù)：

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若N50偏低，可加大 --racon_iterations 5以提高拋光輪次。

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結(jié)果評(píng)估與優(yōu)化建議


核心評(píng)估指標(biāo)

  • Contig N50：理想值應(yīng)接近全基因組長(zhǎng)度（~4.6 Mb）；

  • 閉環(huán)比例：檢查 assembly.fasta 中 circular=true 標(biāo)簽；

  • BUSCO 完整性：目標(biāo)細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)中完整度 ≥95%。


常見問(wèn)題及處理建議

  • Contig 碎片化：

二代：增加測(cè)序深度，調(diào)整 --min_kmer_coverage；

三代：嘗試提高 --min_overlap（如設(shè)為5000）。

  • 嵌合體污染：使用BLAST或MUMmer對(duì)比參考基因組，排查異常區(qū)域。

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總結(jié)

在這兩期推文中，我們?cè)敿?xì)介紹了 Unicycler 在微生物基因組組裝中的應(yīng)用場(chǎng)景、核心原理與實(shí)操策略，涵蓋了 Illumina 與 Nanopore 等不同平臺(tái)的組裝優(yōu)化方案。Unicycler 憑借其對(duì) De Bruijn 圖與字符串圖的融合設(shè)計(jì)，以及自動(dòng)糾錯(cuò)與環(huán)化輸出機(jī)制，在原核基因組研究中表現(xiàn)出色。

后續(xù)我們將陸續(xù)推出以下專題，幫助大家從入門到進(jìn)階掌握二代/三代測(cè)序分析技能：

  • 三代數(shù)據(jù)質(zhì)控與糾錯(cuò)工具詳解（如 Filtlong、NanoFilt、Racon、Medaka）

  • 宏基因組組裝與 binning 技術(shù)實(shí)戰(zhàn)

  • 基于圖的可視化分析工具（Bandage、IGV、Tablet）

  • 長(zhǎng)短讀混合組裝工具對(duì)比（如 Flye、HybridSPAdes、MaSuRCA 等）

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