飛摩爾級“細(xì)胞哨兵”:當(dāng)智能生物傳感器遇上ChemiDoc MP熒光成像

來源: | 作者:/ | 發(fā)布時間: 2025-06-12 | 277 次瀏覽 | 分享到:

智能生物傳感器與合成生物學(xué)

新型生物傳感器設(shè)計是合成生物學(xué)發(fā)展的一個重要分支和方向。通過合成生物學(xué)技術(shù)，生物傳感器的生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件可被有效優(yōu)化，提高靈敏度和特異性。經(jīng)合成生物學(xué)設(shè)計的新型生物傳感器可用于：

環(huán)境監(jiān)測：利用合成生物學(xué)設(shè)計的生物傳感器可以檢測環(huán)境中的污染物，如重金屬離子、有機(jī)污染物等。這些生物傳感器可以被整合到微生物中，使其在污染環(huán)境中生存并發(fā)出信號，幫助監(jiān)測和治理環(huán)境污染。
醫(yī)療診斷：合成生物學(xué)可以設(shè)計出能夠檢測疾病標(biāo)志物的生物傳感器，如檢測血液中的特定蛋白質(zhì)或核酸。這些生物傳感器可以被整合到便攜式設(shè)備中，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)場診斷。
農(nóng)業(yè)應(yīng)用：通過合成生物學(xué)設(shè)計的生物傳感器可以檢測植物病原體或土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)，幫助農(nóng)民及時采取措施，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。

其中，細(xì)菌監(jiān)測器已被用于檢測環(huán)境中的各種信號，例如：能感應(yīng)TNT的細(xì)菌被用于探測地雷、記憶電路用于記錄糞便樣本中的水平基因轉(zhuǎn)移、記憶電路用于診斷尿糖等?？莶菅挎邨U菌是理想的“哨兵細(xì)胞”類型，可以在保持重組DNA完整性的同時存活數(shù)年。芽孢可以承受惡劣的條件，包括輻射、剪切應(yīng)力、高溫、高滲透壓、缺氧條件、真空和氧化應(yīng)激。

檢測環(huán)境DNA的“哨兵細(xì)胞”

麻省理工學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)利用基因工程改造的芽孢桿菌設(shè)計了智能生物傳感器“哨兵細(xì)胞”，來監(jiān)測環(huán)境中的DNA序列，特別是人類DNA序列。這種技術(shù)有望在法醫(yī)學(xué)、生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。他們設(shè)計的“哨兵細(xì)胞”將DNA攝取能力提高了3000倍，能夠在背景DNA中檢測到飛摩爾級別的目標(biāo)DNA。

研究者展示了單個細(xì)胞或細(xì)胞群體能夠同時記錄多個不同的DNA序列。通過構(gòu)建一個包含多個記錄器的細(xì)胞，或者通過構(gòu)建一個包含多個不同細(xì)胞的群體，每個細(xì)胞記錄不同的序列，實(shí)現(xiàn)了對多個SNPs的同時記錄，并且在細(xì)胞內(nèi)被保護(hù)免受核酸酶的降解，即使在惡劣環(huán)境下也能保持?jǐn)?shù)周。這一結(jié)果發(fā)表在權(quán)威期刊《Nature Chemical Biology》上（文獻(xiàn)1）。

研究背景

環(huán)境DNA監(jiān)測的重要性：

所有生物都會向環(huán)境中釋放DNA，這些DNA可以用于追蹤生物的存在，包括病毒、動物和植物。例如，通過監(jiān)測環(huán)境中的DNA，可以追蹤瀕危物種、識別犯罪現(xiàn)場的嫌疑人或診斷農(nóng)業(yè)病原體。

現(xiàn)有技術(shù)的局限性：

傳統(tǒng)的環(huán)境DNA檢測方法存在一些挑戰(zhàn)，如需要連續(xù)采樣、對非目標(biāo)序列的干擾敏感、樣本制備復(fù)雜、條件敏感、通量低和成本高等。

細(xì)菌哨兵的優(yōu)勢：

細(xì)菌哨兵可以作為長期監(jiān)測環(huán)境DNA的工具，因?yàn)樗鼈兛梢栽诃h(huán)境中生存并記錄DNA序列。特別是芽孢桿菌（Bacillus subtilis），它能夠形成孢子，具有很強(qiáng)的環(huán)境耐受性，并且可以整合外源DNA到其基因組中。

“哨兵細(xì)胞”的構(gòu)建

哨兵細(xì)胞基因組包含一個人類序列（藍(lán)色），該序列包圍著所需的SNP（黑色）。當(dāng)人類DNA從環(huán)境中獲取時，SNP（A）被記錄在基因組中，并且由于終止子（TT）的切除，基因（gfp）得以表達(dá)。五個人類DNA序列，包含與面部形態(tài)相關(guān)的SNP。

參考SNP等位基因列于括號中。標(biāo)簽a和b分別表示上游和下游同源臂（SNP本身包含在a中）。超活性枯草芽孢桿菌SCK6的示意圖，以及一組原生基因組編碼基因（虛線框），這些基因由主調(diào)控因子ComK的過表達(dá)（包括自身調(diào)節(jié)）激活。

“哨兵細(xì)胞”對DNA的攝取

下圖展示了作為“哨兵細(xì)胞”的超感受態(tài)枯草芽孢桿菌從環(huán)境中攝取DNA的原理及實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

a，人類序列（a和b）被插入基因組。在攝取并整合包含表達(dá)盒兩側(cè)人類序列的外源DNA后，細(xì)胞發(fā)出熒光并對卡那霉素產(chǎn)生抗性。

b，數(shù)據(jù)顯示了SEQ1gfp/kan的攝取和記錄。其他四個序列的攝取情況顯示在擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1中?！癉NA記錄頻率”為Kanr+GFP+菌落形成單位 (cfu) 數(shù)除以菌落形成單位總數(shù)。

c，枯草芽孢桿菌S1-S5在木糖存在下對SEQ1gfp/kan-SEQ5gfp/kan的攝取數(shù)據(jù)。黑線為方程1的擬合曲線。

d，將枯草芽孢桿菌S1與相同的SEQ1gfp/kan質(zhì)粒或線性產(chǎn)物孵育，比較了環(huán)狀或線性DNA的攝取和整合情況。線性靶DNA序列上的同源臂a和b兩側(cè)分別連接了取自人類基因組的1kb序列（藍(lán)色虛線框）。

“哨兵細(xì)胞”的報告基因

研究使用綠色熒光蛋白（GFP）和氯霉素抗性基因（camR）兩種報告基因，分別用于快速熒光檢測并提高靈敏度和特異性。這兩種報告基因的結(jié)合使用，使得研究者能夠準(zhǔn)確地監(jiān)測和記錄目標(biāo)DNA序列在哨兵細(xì)胞中的攝取和整合過程。

1.綠色熒光蛋白（GFP）

GFP被用于監(jiān)測哨兵細(xì)胞是否成功攝取并整合了含有特定SNP的目標(biāo)DNA序列。當(dāng)目標(biāo)DNA序列被整合到細(xì)胞基因組中后，GFP基因的表達(dá)被激活，細(xì)胞發(fā)出熒光，表明目標(biāo)DNA序列已被成功記錄。

2.氯霉素抗性基因（camR）

camR基因用于提高檢測的靈敏度和特異性，通過選擇性培養(yǎng)基（含有氯霉素）篩選出成功記錄目標(biāo)DNA序列的細(xì)胞，從而提高了檢測的靈敏度。此外，camR基因的使用也減少了背景突變的干擾，提高了檢測的準(zhǔn)確性。

熒光菌落成像及驗(yàn)證DNA記錄

實(shí)驗(yàn)中，Bacillus subtilis細(xì)胞被設(shè)計為在成功攝取并整合目標(biāo)DNA序列后表達(dá)GFP。通過檢測GFP的熒光信號，可以確定哪些細(xì)胞成功記錄了目標(biāo)DNA序列。使用ChemiDoc MP成像系統(tǒng)對培養(yǎng)皿進(jìn)行成像，以觀察和記錄熒光信號。這有助于篩選出成功表達(dá)GFP的細(xì)胞，從而確認(rèn)目標(biāo)DNA序列的攝取和整合。

平板中挑取菌落，并分析終止子的存在。菌落1和2來自-DNA平板（均為GFP陰性），菌落3和4來自+SEQ#平板（但為GFP陰性），菌落5-8來自+SEQ#平板，且為GFP陽性。

ChemiDoc MP全能成像系統(tǒng)

Bio-Rad ChemiDoc MP全能型成像系統(tǒng)具有獨(dú)特的五通道熒光，波長覆蓋從藍(lán)、綠、紅到近紅外，具備完整的分子成像功能，如核酸凝膠成像、蛋白凝膠成像、Western Blot化學(xué)發(fā)光成像、WesternBlot多色熒光成像、紅外熒光成像及免染成像，甚至具備切膠功能。ChemiDoc MP系統(tǒng)搭載了創(chuàng)新的CCD芯片及光學(xué)定焦鏡頭，保證了成像所必需的靈敏度與分辨率。