dPCR MIQE是如何指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的？（一）

來(lái)源: | 作者:/ | 發(fā)布時(shí)間: 2024-01-15 | 1260 次瀏覽 | 分享到:

提起PCR，在生物及其相關(guān)行業(yè)內(nèi)可謂如雷貫耳，無(wú)人不知無(wú)人不曉，其影響之深，應(yīng)用之廣可見(jiàn)一斑。實(shí)時(shí)熒光定量PCR目前已經(jīng)成為快速、精確定量核酸的權(quán)威性方法之一，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比數(shù)字PCR的重復(fù)性更高、受抑制的影響更小。數(shù)字PCR由于其優(yōu)越的絕對(duì)定量技術(shù)，也正在蓬勃發(fā)展，涉及包括農(nóng)業(yè)、環(huán)境、工業(yè)和醫(yī)學(xué)研究等多個(gè)領(lǐng)域。為了幫助科學(xué)家能產(chǎn)生一致的、高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments（dMIQE）指南應(yīng)運(yùn)而生。

該指南正被全世界越來(lái)越多的研究人員、生物期刊、學(xué)術(shù)和商業(yè)機(jī)構(gòu)支持。dPCR MIQE指南是一個(gè)全球標(biāo)準(zhǔn)化的成功案例，該指南規(guī)定了實(shí)驗(yàn)和發(fā)表文章時(shí)所必須的最低實(shí)驗(yàn)信息，規(guī)范了整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，以確保實(shí)驗(yàn)的實(shí)用性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無(wú)法重復(fù)？結(jié)果質(zhì)量無(wú)法評(píng)估？因信息缺失被拒稿？下面我們一起來(lái)了解一下dMIQE清單是從哪些方面去確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的：

dMIQE清單

檢查項(xiàng)目	重要性
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
定義實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組	E
對(duì)每個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行編號(hào)	E
該實(shí)驗(yàn)實(shí)在中心實(shí)驗(yàn)室還是PI實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行？	D
樣本
描述	E
樣本處理體積或質(zhì)量	E
顯微切割還是宏觀切割？	E
處理程序	E
如果冰凍：狀態(tài)如何，是如何快速處理的？	E
如果固定：用什么固定，是如何快速處理的？	E
樣本儲(chǔ)存條件和時(shí)間 [特別是福爾馬林固定和石蠟包埋（FFPE）樣品]	E
核酸提取
定量-儀器/方法	E
儲(chǔ)存條件：溫度、濃度、時(shí)間、緩沖液	E
DNA/RNA定量	E
質(zhì)量/完整性-儀器/方法；例如RIN/RQI和軌跡或 3‘：5’	E
模板結(jié)構(gòu)信息	E
模板修飾（酶解、超聲、預(yù)擴(kuò)增等）	E
模板處理（初始加熱或化學(xué)變性）	E
抑制劑稀釋或標(biāo)記	E
RNA樣品的DNA污染評(píng)估	E
進(jìn)行DNaes處理的詳細(xì)信息	E
所用試劑的制造商和目錄號(hào)	D
核酸儲(chǔ)存條件：溫度、濃度、時(shí)間、緩沖液	E
逆轉(zhuǎn)錄（如有必要）
cDNA制備方法+濃度	E
一步法或兩步法	E
每個(gè)反應(yīng)RNA的使用量	E
反應(yīng)體系及反應(yīng)條件	E
RT效率	D
添加RT和不添加RT條件下測(cè)得的估計(jì)拷貝數(shù)	D
所用試劑的生產(chǎn)廠家和目錄號(hào)	D
應(yīng)體積（兩步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）	D
cDNA的儲(chǔ)存條件：溫度、濃度、時(shí)間、緩沖液	D
dPCR目標(biāo)信息
序列登錄號(hào)	E
擴(kuò)增子位置	D
擴(kuò)增子長(zhǎng)度	E
特異性篩選軟件（如BLAST等）	E
假基因，逆轉(zhuǎn)錄假基因或其他同源物？	D
序列比對(duì)	D
擴(kuò)增序列二級(jí)結(jié)構(gòu)和GC含量分析	D
各引物的外顯子或內(nèi)含子位置（如果適用）	E
在適當(dāng)?shù)那闆r下，針對(duì)哪些剪切體？	E
dPCR引物
引物序列和/或擴(kuò)增基因上下游序列	E
RT引物的數(shù)據(jù)庫(kù)的ID號(hào)	D
探針序列	D
所有結(jié)合位點(diǎn)和修飾信息	E
引物制造商	D
純化方法	D
dPCR反應(yīng)條件
反應(yīng)條件	E
RNA/cDNA/DNA的反應(yīng)體系和量	E
引物（探針）、Mg2+、dNTP濃度	E
聚合酶種類(lèi)和濃度	E
緩沖液/試劑盒目錄號(hào)和生產(chǎn)廠家	E
緩沖液化學(xué)組成	D
添加劑（SYBR Green、DMSO等）	E
反應(yīng)管/板的制造商和產(chǎn)品目錄號(hào)	D
熱循環(huán)參數(shù)	E
反應(yīng)設(shè)置	D
質(zhì)量和體積稀釋?zhuān)ㄊ謩?dòng)/自動(dòng)）	D
PCR反應(yīng)體系總量	D
反應(yīng)單元數(shù)	E
單個(gè)反應(yīng)單元體積	E
測(cè)得的反應(yīng)單元總體積（有效反應(yīng)大?。?/span>	E
反應(yīng)單元體積差異/標(biāo)準(zhǔn)偏差	D
對(duì)照組的詳細(xì)設(shè)計(jì)和使用	E
dPCR儀器生產(chǎn)廠家	E
dPCR驗(yàn)證
分析優(yōu)化的數(shù)據(jù)	D
特異性（在測(cè)量稀有突變、病原體序列等時(shí)）	E
校準(zhǔn)品控制的檢出限	D
如果是多重分析，同單重分析比較	E
數(shù)據(jù)分析
每個(gè)反應(yīng)單元平均拷貝數(shù)（λ或等效值）	E
dPCR分析程序（來(lái)源、版本）	E
異常值的識(shí)別和處理	E
NTC的結(jié)果	E
作為補(bǔ)充數(shù)據(jù)的陽(yáng)性和陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例	E
在適當(dāng)?shù)那闆r下，證明參考基因的數(shù)據(jù)和選擇理由	E
在適當(dāng)?shù)那闆r下，對(duì)歸一化方法進(jìn)行描述	E
生物學(xué)重復(fù)的數(shù)量和一致性	D
技術(shù)重復(fù)的次數(shù)和階段(RT或qPCR）	E
重復(fù)性（批內(nèi)變異）	E
重現(xiàn)性（批間/用戶(hù)/實(shí)驗(yàn)室等變異）	D
實(shí)驗(yàn)方差或置信區(qū)間	E
統(tǒng)計(jì)方法分析	E
使用RDML提交原始數(shù)據(jù)	D

注：E表示“必須”，D表示建議。

上述dMIQE指南由9個(gè)部分組成，共涉及83個(gè)參數(shù)，以保證dPCR實(shí)驗(yàn)的實(shí)用性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。這9 部分包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、靶標(biāo)基因、dPCR引物和探針、dPCR反應(yīng)條件、dPCR驗(yàn)證和數(shù)據(jù)分析。83個(gè)參數(shù)針對(duì)dPCR結(jié)果的重要性，分為了兩類(lèi)：其中標(biāo)記為“E”表示必須(essential)，標(biāo)記為“D”表示建議(desirable)。因此研究人員使用這個(gè)使用技術(shù)指南可以產(chǎn)生更規(guī)范，更可比，更可知的數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

1、GB-T42077-2022生物技術(shù)核酸靶序列定量方法的性能評(píng)價(jià)要求qPCR法和dPCR法。

2、The Digital MIQE Guidelines Update:Minimum Information for Publication of QuantitativeDigital PCR Experiments for 2020

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