【文章分享】小鼠人源化肝臟代謝景觀的全面基因分析

來源: | 作者:/ | 發(fā)布時(shí)間: 2024-03-11 | 1056 次瀏覽 | 分享到:

標(biāo)題：Comprehensive gene profiling of the metabolic landscape of humanized livers in mice

中文標(biāo)題：小鼠人源化肝臟代謝景觀的全面基因分析

期刊全稱：Journal of Hepatology

影響因子：25

發(fā)布時(shí)間：2023年12月3日

原文鏈接：https://www.journal-of-hepatology.eu/article/S0168-8278(23)05296-0/abstract

研究目的

目的：使用Nanopore探索復(fù)雜動(dòng)態(tài)的人類肝臟轉(zhuǎn)錄組，建立人類肝臟轉(zhuǎn)錄組的從頭注釋。

?人類肝臟轉(zhuǎn)錄組是復(fù)雜且高度動(dòng)態(tài)的，例如，一個(gè)基因可以產(chǎn)生多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄物，每個(gè)轉(zhuǎn)錄物具有不同的轉(zhuǎn)錄后修飾。

?人類肝臟無法直接接受處理，并且人類肝臟轉(zhuǎn)錄組在轉(zhuǎn)錄和RNA修飾水平上的注釋不足，這在很大程度上掩蓋了對人類肝臟轉(zhuǎn)錄組的直接了解。

研究方法

?作者培育了攜帶相同遺傳背景的人源化肝臟小鼠。

?這些小鼠嵌入的人源化肝細(xì)胞分別來自兩個(gè)不同死亡原因的供體，并且對小鼠進(jìn)行了饑餓以及不同轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的代謝處理。

?作者使用無核酸酶水將75 μg的提取的RNA調(diào)整至100 μL體積。隨之，使用Dynabeads? mRNA 純化試劑盒富集poly(A)尾RNA，并將500 ng的具有poly(A)尾RNA用于Nanopore直接RNA測序 (Oxford Nanopore Technologies ,DRS)。采用SQK-RNA002試劑盒方案進(jìn)行文庫構(gòu)建，同時(shí)，建庫過程中也采納了ONT推薦的可選逆轉(zhuǎn)錄步驟的建議。將構(gòu)建好的文庫加載到ONT R9.4.1流動(dòng)槽（Oxford Nanopore Technologies）上，并使用GridION平臺(tái)進(jìn)行測序。通過測序數(shù)據(jù)分析人源化肝臟小鼠，確定所有RNA轉(zhuǎn)錄亞型的表達(dá)水平、m6A修飾和poly(A)尾長度。

?對人類和小鼠之間以及兩個(gè)個(gè)體之間的基因調(diào)控進(jìn)行了比較分析。

研究結(jié)果

?為了建立人類肝臟轉(zhuǎn)錄組的從頭注釋，作者首先對來自同一供體的人源化肝臟小鼠進(jìn)行飲食干預(yù)和轉(zhuǎn)錄因子激活處理，并結(jié)合Nanopore直接RNA測序、illumina短讀長測序以及ATAC測序的結(jié)果來分析RNA代謝調(diào)節(jié)。由此，作者發(fā)現(xiàn)了大量新基因和轉(zhuǎn)錄本，還發(fā)現(xiàn)了許多受調(diào)控的代謝途徑。

? 作者擴(kuò)展了人和小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組的從頭注釋，與參考注釋中的亞型相比，54.6%的人類和70.8%的小鼠轉(zhuǎn)錄本亞型是新的。作者評(píng)估了這些新轉(zhuǎn)錄本的基因的亞型組成,發(fā)現(xiàn)超過40%的這些新轉(zhuǎn)錄本顯示出與當(dāng)前參考數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)編碼序列不同。作者在基因間區(qū)域中鑒定了212個(gè)新基因，并隨機(jī)克隆了一些新基因，驗(yàn)證了分析結(jié)果的可靠性。隨之，作者進(jìn)行通路富集分析，表明hNovel3與類固醇生物合成通路相關(guān)，并將基因敲除后，佐證了這一觀點(diǎn)。

?m6A和poly(A)尾長在調(diào)節(jié)RNA代謝和生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。作者使Nanopore DRS測序分析m6A修飾時(shí)發(fā)現(xiàn)，m6A修飾修飾位點(diǎn)在編碼區(qū)域和3 ‘UTR區(qū)域中富集。通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，進(jìn)行飲食干預(yù)和轉(zhuǎn)錄因子激活處理后的人源化肝臟小鼠，3’UTR中m6A修飾存在顯著差異，而在編碼序列區(qū)域中沒有發(fā)現(xiàn)這種差異。經(jīng)過通路分析表明，這些差異調(diào)節(jié)的m6A修飾發(fā)生在脂肪酸和酒精代謝中關(guān)鍵代謝基因的轉(zhuǎn)錄本上。

?Nanopore的DRS測序可以精確確定轉(zhuǎn)錄本上的poly(A)尾長度。作者發(fā)現(xiàn)人源化肝臟中所有人類轉(zhuǎn)錄物上poly(A)尾長的平均長度約為100個(gè)核苷酸，并且，轉(zhuǎn)錄本的poly(A)尾長度與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)趨勢。通過方差分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，進(jìn)行飲食干預(yù)和轉(zhuǎn)錄因子激活處理的人源化肝臟小鼠，轉(zhuǎn)錄本上的poly(A)尾長度的分布因基因而異。經(jīng)過通路分析表明，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄因子FXR, PPARα, and PPARγ激活處理，均影響poly(A)尾長的主要代謝通路。

?遺傳背景對個(gè)體的基因調(diào)控和疾病易感性有很大影響。作者通過兩個(gè)供體之間的測序結(jié)果評(píng)估個(gè)體之間轉(zhuǎn)錄組的差異。作者發(fā)現(xiàn)在第二個(gè)供體（供體2）中檢測到的大約55%的RNA轉(zhuǎn)錄本與第一個(gè)供體（供體1）中的RNA轉(zhuǎn)錄本相匹配，但是仍有約20%的轉(zhuǎn)錄亞型存在明顯差異。例如，通過納米孔DRS在供體2中檢測到新基因ebabaf4b的全長，在供體1中未檢測到信號(hào)。并且，兩個(gè)供體中轉(zhuǎn)錄本的一致變化都參與了主要的代謝途徑，而相反調(diào)節(jié)的基因大多富集在炎癥防御反應(yīng)中。