多重dPCR的設(shè)計同樣類似于qPCR多重設(shè)計，引物探針數(shù)量（重數(shù)）增加需要額外考慮序列間的互補(bǔ)配對，以避免非特異性雜交或二聚體形成。在進(jìn)行多重設(shè)計時，應(yīng)優(yōu)先考慮使用多通道進(jìn)行區(qū)分。多通道分析可以提高分析效率，減少樣本使用量，并可以在單個反應(yīng)中進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)控。多重分析還有其他優(yōu)點(diǎn)，例如在分析拷貝數(shù)變異時，成對的目標(biāo)基因和內(nèi)參基因可使用雙通道同時檢測同一樣本。類似的，在使用水解探針分析單核苷酸突變或插入/缺失時，使用雙通道也是首選方法。使用“drop-off”分析方法時，基因型是通過單、雙陽性信號簇來進(jìn)行分析的，使用單通道則無法完成。

雙色分析也可用于識別一些可能難以通過單色分析識別的技術(shù)瑕疵。例如，當(dāng)使用單色分析時會發(fā)生向另外通道的熒光滲透（或稱為信號串?dāng)_或溢出），如果雙重檢測實(shí)驗(yàn)在各自通道中單獨(dú)顯示微滴（編者案：即1D通道圖），熒光滲透微滴可能被顯示為附加簇（編者案：即被誤認(rèn)為是熒光拖尾）而誤認(rèn)為分析特異性降低（如圖Fig.1）。在多通道中，熒光滲透清晰地表現(xiàn)為單個正極分區(qū)從預(yù)期軸向雙正極分區(qū)的預(yù)期位置“傾斜”或“升高”（Fig.2）。熒光滲透可以在雙檢測通道中通過使用僅含單引物探針和單一靶向模板的測試，如果信號簇“傾斜”或“提升”到另一個“熒光軸”區(qū)域，則為滲透。可以通過降低相關(guān)探針的濃度、改變熒光集團(tuán)和/或應(yīng)用顏色補(bǔ)償矩陣來減少滲透。

如果清楚原因，熒光滲透通常是可以容忍的。如果使用單熒光通道檢測時滲透現(xiàn)象消失，說明可能是其他原因引起的，例如Assay的特異性降低（造成的）。探針與相似序列（例如在單核苷酸突變檢測中）非特異性結(jié)合，使特異性變低。雖然這可能很小，但可能會出現(xiàn)類似熒光穿透的“傾斜”或“提升”（Fig.3），從而降低結(jié)果的峰值分辨率。當(dāng)突變體的其中一種占主導(dǎo)時，cfDNA中的罕見突變會由于“PCR錯誤造成的假陽性”因素而限制最低檢出豐度（Fig.4）。

當(dāng)微滴包裹了同一位點(diǎn)的野生和突變的模板時，在雙陽性區(qū)域微滴中會發(fā)生引物對的競爭反應(yīng)，競爭同一對引物后，相比于單一模板的微滴，陽性信號會由于競爭反應(yīng)而降低。即便使用單通道讀取結(jié)果，競爭反應(yīng)也同樣會發(fā)生并使信號峰降低。使用“drop-off”方法時，競爭反應(yīng)使得雙陽性微滴中呈現(xiàn)雙信號簇，可以使用前面概述的優(yōu)化和質(zhì)量控制方案來評估分區(qū)特定的競爭（PSC）、熒光滲透和其他因素的影響。