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數(shù)字PCR應(yīng)用于結(jié)直腸癌甲基化檢測(cè)

來(lái)源: | 作者:/ | 發(fā)布時(shí)間: 2024-09-02 | 651 次瀏覽 | 分享到:

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC) 

全球男性第3、女性第2常見(jiàn)惡性腫瘤 

死亡率全球癌癥第4位

每年約69.4萬(wàn)人因此喪生


對(duì)于早期CRC患者，多數(shù)可以治愈，5年生存率可達(dá)90%，而晚期患者則不足10%。結(jié)腸鏡檢查被認(rèn)為是預(yù)防結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其昂貴的價(jià)格和侵入性特征，以及需要腸道準(zhǔn)備等因素，導(dǎo)致了患者依從性差。同時(shí)還存在著出血穿孔、漏診等隱患。糞便潛血試驗(yàn)靈敏度和特異性高，但受藥物和飲食的影響很大。而且多數(shù)CRC患者確診時(shí)已到中晚期，早期CRC缺乏典型臨床癥狀不易察覺(jué)，因此有效的早期診斷方法可以降低CRC的發(fā)病率和病死率，提高患者生存率。



許多研究表明，檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)中的DNA突變和異常甲基化可以為早期結(jié)直腸癌篩查提供新的方法。DNA甲基化可以通過(guò)改變基因表達(dá)來(lái)影響腫瘤發(fā)生。腫瘤特異性DNA甲基化出現(xiàn)在腫瘤發(fā)展的早期。血漿SEPT9啟動(dòng)子區(qū)甲基化已在結(jié)直腸癌中進(jìn)行了廣泛的研究，研究表明SEPT9甲基化用于診斷結(jié)直腸癌的靈敏度在48.2％到95.6％之間，特異度在69％到97.1％之間。SEPT9甲基化已經(jīng)被證實(shí)是結(jié)直腸癌血漿檢測(cè)的高度靈敏和特異性的生物標(biāo)志物，并且于2016年獲得了美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的批準(zhǔn)。但是SEPT9也在其他癌癥血漿中例如肺癌，頭頸部癌癥，胃癌中均呈現(xiàn)不同程度的高甲基化。因此，用于結(jié)直腸癌早期診斷的ctDNA特異性甲基化生物標(biāo)記物仍有待進(jìn)一步研究。



ctDNA在cfDNA中的占比在0.01％到60％不等，其濃度和腫瘤體積、分期、血管化、增殖率和細(xì)胞死亡率相關(guān)。因此要對(duì)ctDNA甲基化水平實(shí)現(xiàn)靈敏可重復(fù)的檢測(cè)是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。目前SEPT9檢測(cè)試劑盒使用的是將甲基化特異性PCR(MSP)與TaqMan探針結(jié)合的檢測(cè)方法，稱(chēng)MethyLight，其可以在校正DNA載量和標(biāo)準(zhǔn)化甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)品后，以相對(duì)方式定量甲基化等位基因的量，大大提高了檢測(cè)和定量甲基化等位基因的能力。然而，MethyLight仍然容易受到PCR抑制劑的影響，在未甲基化等位基因背景下檢測(cè)稀有甲基化等位基因的靈敏度有限，并可能在標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程中出現(xiàn)偏差，這可能導(dǎo)致結(jié)果不一致，尤其是在檢測(cè)低水平的DNA甲基化方面（包括低濃度和低分子量）。因此，常規(guī)的甲基化特異性定量PCR通常不能達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)低水平DNA甲基化并以此作為癌癥生物標(biāo)志物的靈敏度。



數(shù)字PCR(droplet digital PCR)是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，其最初被定義為單分子模板PCR擴(kuò)增，其將樣品分離成單個(gè)分子并通過(guò)PCR擴(kuò)增；通過(guò)終點(diǎn)信號(hào)的存在來(lái)判斷陰性和陽(yáng)性，結(jié)合泊松分布來(lái)計(jì)算原始樣品中的拷貝數(shù)；數(shù)字PCR受擴(kuò)增效率及PCR抑制物的影響較小。有研究顯示數(shù)字PCR可以從背景DNA中檢測(cè)到0.001％的靶基因突變。Ming等人證明相比于常規(guī)MethyLight PCR，MethyLight ddPCR的定量下限(LOQ)降低25倍，檢測(cè)限(LOD)降低20倍。因此MethyLight ddPCR是一種更適合于檢測(cè)ctDNA甲基化水平的技術(shù)。


數(shù)字PCR甲基化檢測(cè)流程

01

引物及探針設(shè)計(jì)

選擇與癌癥特異性/靈敏性高的腫瘤標(biāo)志物；針對(duì)篩選的位點(diǎn)，例如Septin9、BMP3、SDC2、RAFF1A等設(shè)計(jì)甲基化引物探針及非甲基化引物探針。

02

從樣本中提取核酸，獲得待測(cè)DNA

03

對(duì)DNA樣品進(jìn)行甲基化處理

使用ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation?Lightning Kit試劑盒對(duì)獲取的DNA樣本進(jìn)行甲基化處理，具體步驟如下：

1、將20μl核酸提取產(chǎn)物與130μl的Lightning Conversion Reagent加入到200μl的離心管中；


2、放入PCR儀中處理：98℃ 8min；54℃ 60min；


3、向收集柱中加600μl的M?Binding Buffer，在加入150μl的步驟2產(chǎn)物，輕輕顛倒幾次，10000xg離心1min；


4、棄收集管中液體，向收集柱中加100μl的M?Wash Buffer，10000xg離心1min；


5、棄收集管中液體，向收集柱中加200μl的L?Desulphonation Buffer，靜置15min，10000xg離心1min；


6、棄收集管中液體，向收集柱中加200μl的M?Wash Buffer，10000xg離心1min；


7、將收集柱放入到1.5ml離心管中，向收集柱中加10μl的M?Elution Buffer，  10000xg離心1min。

04

配置PCR反應(yīng)液

以甲基化處理后的核酸為模板配置20μL的PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液為基于數(shù)字PCR方法的結(jié)直腸癌甲基化檢測(cè)用PCR反應(yīng)液。

05

制備反應(yīng)微滴

將配制好的20μL PCR反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡(DG8 cartridge)sample孔中，再加入70μL微滴發(fā)生油(droplet generation oil)至oil孔中，利用QX200 TM微滴式數(shù)字PCR儀的微滴生成器制備反應(yīng)微滴。每個(gè)微滴發(fā)生卡一次可同時(shí)完成8個(gè)樣品的微滴制備，用時(shí)約2.5min。

06

PCR擴(kuò)增

將每個(gè)樣品的微滴分別轉(zhuǎn)移至96孔PCR反應(yīng)板對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔中，用鋁膜熱封(180℃,5 sec)后，于普通PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

07

擴(kuò)增結(jié)束采用閱讀儀進(jìn)行結(jié)果讀取


總結(jié)與展望

隨著腫瘤表觀遺傳學(xué)研究的深入，可以用作腫瘤診斷的新型生物標(biāo)志物被不斷拓展。DNA甲基化作為新的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床上的微創(chuàng)診斷、預(yù)后評(píng)估、預(yù)測(cè)治療反應(yīng)、監(jiān)測(cè)病情等方面，不斷展示其可能的潛在應(yīng)用價(jià)值，為CRC篩查和早期診斷提供了不同于傳統(tǒng)方法的全新手段，極具開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用潛力。


參考文獻(xiàn)


1、 Combined SEPT9 and BMP3 methylation in plasma for colorectal cancer early detection and screening in aBrazilian population，Cancer Med. 2023 Aug;12(15):15854-15867. doi: 10.1002/cam4.6224. Epub 2023 Jun 20.

2、 Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021 May;71(3):209-249

3、 國(guó)家癌癥中心中國(guó)結(jié)直腸癌篩查與早診早治指南制定專(zhuān)家組.中國(guó)結(jié)直腸癌篩查與早診早治指南(2020, 北京)[J].中華腫瘤雜志,2021,43(01):16-38.

4、 Analysis of DNA methylation in cancer:location revisited .Nat RevClin Oncol .2018；15(7):459-466

5、 MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequently methylated alleles .Epigenetics .

2015；10(9):803-9 .