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數字PCR應用于結直腸癌甲基化檢測

來源: | 作者:/ | 發(fā)布時間: 2024-09-02 | 674 次瀏覽 | 分享到:

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC) 

全球男性第3、女性第2常見惡性腫瘤 

死亡率全球癌癥第4位

每年約69.4萬人因此喪生


對于早期CRC患者，多數可以治愈，5年生存率可達90%，而晚期患者則不足10%。結腸鏡檢查被認為是預防結直腸癌的金標準，但是其昂貴的價格和侵入性特征，以及需要腸道準備等因素，導致了患者依從性差。同時還存在著出血穿孔、漏診等隱患。糞便潛血試驗靈敏度和特異性高，但受藥物和飲食的影響很大。而且多數CRC患者確診時已到中晚期，早期CRC缺乏典型臨床癥狀不易察覺，因此有效的早期診斷方法可以降低CRC的發(fā)病率和病死率，提高患者生存率。



許多研究表明，檢測循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)中的DNA突變和異常甲基化可以為早期結直腸癌篩查提供新的方法。DNA甲基化可以通過改變基因表達來影響腫瘤發(fā)生。腫瘤特異性DNA甲基化出現在腫瘤發(fā)展的早期。血漿SEPT9啟動子區(qū)甲基化已在結直腸癌中進行了廣泛的研究，研究表明SEPT9甲基化用于診斷結直腸癌的靈敏度在48.2％到95.6％之間，特異度在69％到97.1％之間。SEPT9甲基化已經被證實是結直腸癌血漿檢測的高度靈敏和特異性的生物標志物，并且于2016年獲得了美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的批準。但是SEPT9也在其他癌癥血漿中例如肺癌，頭頸部癌癥，胃癌中均呈現不同程度的高甲基化。因此，用于結直腸癌早期診斷的ctDNA特異性甲基化生物標記物仍有待進一步研究。



ctDNA在cfDNA中的占比在0.01％到60％不等，其濃度和腫瘤體積、分期、血管化、增殖率和細胞死亡率相關。因此要對ctDNA甲基化水平實現靈敏可重復的檢測是一項巨大的挑戰(zhàn)。目前SEPT9檢測試劑盒使用的是將甲基化特異性PCR(MSP)與TaqMan探針結合的檢測方法，稱MethyLight，其可以在校正DNA載量和標準化甲基化DNA標準品后，以相對方式定量甲基化等位基因的量，大大提高了檢測和定量甲基化等位基因的能力。然而，MethyLight仍然容易受到PCR抑制劑的影響，在未甲基化等位基因背景下檢測稀有甲基化等位基因的靈敏度有限，并可能在標準化過程中出現偏差，這可能導致結果不一致，尤其是在檢測低水平的DNA甲基化方面（包括低濃度和低分子量）。因此，常規(guī)的甲基化特異性定量PCR通常不能達到準確檢測低水平DNA甲基化并以此作為癌癥生物標志物的靈敏度。



數字PCR(droplet digital PCR)是一種核酸分子絕對定量技術，其最初被定義為單分子模板PCR擴增，其將樣品分離成單個分子并通過PCR擴增；通過終點信號的存在來判斷陰性和陽性，結合泊松分布來計算原始樣品中的拷貝數；數字PCR受擴增效率及PCR抑制物的影響較小。有研究顯示數字PCR可以從背景DNA中檢測到0.001％的靶基因突變。Ming等人證明相比于常規(guī)MethyLight PCR，MethyLight ddPCR的定量下限(LOQ)降低25倍，檢測限(LOD)降低20倍。因此MethyLight ddPCR是一種更適合于檢測ctDNA甲基化水平的技術。


數字PCR甲基化檢測流程

01

引物及探針設計

選擇與癌癥特異性/靈敏性高的腫瘤標志物；針對篩選的位點，例如Septin9、BMP3、SDC2、RAFF1A等設計甲基化引物探針及非甲基化引物探針。

02

從樣本中提取核酸，獲得待測DNA

03

對DNA樣品進行甲基化處理

使用ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation?Lightning Kit試劑盒對獲取的DNA樣本進行甲基化處理，具體步驟如下：

1、將20μl核酸提取產物與130μl的Lightning Conversion Reagent加入到200μl的離心管中；


2、放入PCR儀中處理：98℃ 8min；54℃ 60min；


3、向收集柱中加600μl的M?Binding Buffer，在加入150μl的步驟2產物，輕輕顛倒幾次，10000xg離心1min；


4、棄收集管中液體，向收集柱中加100μl的M?Wash Buffer，10000xg離心1min；


5、棄收集管中液體，向收集柱中加200μl的L?Desulphonation Buffer，靜置15min，10000xg離心1min；


6、棄收集管中液體，向收集柱中加200μl的M?Wash Buffer，10000xg離心1min；


7、將收集柱放入到1.5ml離心管中，向收集柱中加10μl的M?Elution Buffer，  10000xg離心1min。

04

配置PCR反應液

以甲基化處理后的核酸為模板配置20μL的PCR反應液，PCR反應液為基于數字PCR方法的結直腸癌甲基化檢測用PCR反應液。

05

制備反應微滴

將配制好的20μL PCR反應液，轉移至微滴發(fā)生卡(DG8 cartridge)sample孔中，再加入70μL微滴發(fā)生油(droplet generation oil)至oil孔中，利用QX200 TM微滴式數字PCR儀的微滴生成器制備反應微滴。每個微滴發(fā)生卡一次可同時完成8個樣品的微滴制備，用時約2.5min。

06

PCR擴增

將每個樣品的微滴分別轉移至96孔PCR反應板對應的反應孔中，用鋁膜熱封(180℃,5 sec)后，于普通PCR儀上進行擴增。

07

擴增結束采用閱讀儀進行結果讀取


總結與展望

隨著腫瘤表觀遺傳學研究的深入，可以用作腫瘤診斷的新型生物標志物被不斷拓展。DNA甲基化作為新的生物標志物應用于臨床上的微創(chuàng)診斷、預后評估、預測治療反應、監(jiān)測病情等方面，不斷展示其可能的潛在應用價值，為CRC篩查和早期診斷提供了不同于傳統(tǒng)方法的全新手段，極具開發(fā)和臨床應用潛力。


參考文獻


1、 Combined SEPT9 and BMP3 methylation in plasma for colorectal cancer early detection and screening in aBrazilian population，Cancer Med. 2023 Aug;12(15):15854-15867. doi: 10.1002/cam4.6224. Epub 2023 Jun 20.

2、 Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021 May;71(3):209-249

3、 國家癌癥中心中國結直腸癌篩查與早診早治指南制定專家組.中國結直腸癌篩查與早診早治指南(2020, 北京)[J].中華腫瘤雜志,2021,43(01):16-38.

4、 Analysis of DNA methylation in cancer:location revisited .Nat RevClin Oncol .2018；15(7):459-466

5、 MethyLight droplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequently methylated alleles .Epigenetics .

2015；10(9):803-9 .