實(shí)驗(yàn)秘籍 | 瑞孚迪「HTRF技術(shù)」：給你的實(shí)驗(yàn)疊個(gè)BUFF！

來源: | 作者:/ | 發(fā)布時(shí)間: 2024-12-31 | 450 次瀏覽 | 分享到:

實(shí)驗(yàn)通關(guān)秘籍之

HTRF技術(shù)篇

給你的實(shí)驗(yàn)疊個(gè)buff~

說起實(shí)驗(yàn)室常用的免疫檢測方法，

首先想到的就是ELISA與Western Blot。

但是，面對難以省去的眾多實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，

冗長的實(shí)驗(yàn)周期以及繁瑣的操作流程，

即使是經(jīng)驗(yàn)豐富的科研er也難免翻車。

如果此刻的你苦實(shí)驗(yàn)久矣，

不妨了解一下瑞孚迪HTRF技術(shù)！

Principle of HTRF

什么是「HTRF」技術(shù)？

原理

HTRF(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence)技術(shù)源自于諾貝爾獎成果，是一種同時(shí)兼具TR(Time Resolved，時(shí)間分辨)技術(shù)和FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光能量共振轉(zhuǎn)移)技術(shù)的在均相（溶液）反應(yīng)體系中的分析技術(shù)，經(jīng)過三十余年的技術(shù)沉淀，已被超萬篇高分文獻(xiàn)引用。

TR技術(shù)利用稀土元素中鑭系元素(Eu、Tb、Sm等)的獨(dú)特性質(zhì)，其熒光比普通熒光持續(xù)時(shí)間更長，普通熒光的半衰期為納秒級，鑭系元素的半衰期是毫秒級，有6個(gè)數(shù)量級的差別。所以，在檢測時(shí)，每個(gè)激發(fā)光脈沖過后，通過延緩檢測時(shí)間，讓短壽命的熒光衰變掉后，再檢測稀土穴狀化合物的熒光強(qiáng)度，幾乎可以完全消除背景熒光的干擾，提高靈敏度，反映樣品的實(shí)際情況（圖1）。

圖1

FRET 技術(shù)（圖2）利用了2種熒光基團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移，這2種熒光基團(tuán)分別稱為能量供體和能量受體。能量供體被外來光源激發(fā)（例如氙燈或激光），如果它與受體比較接近，可以將能量共振轉(zhuǎn)移到受體上，使受體受到激發(fā)，發(fā)出特定波長的發(fā)射光。當(dāng)供體和受體分別與相互作用的2個(gè)生物分子結(jié)合，生物分子的結(jié)合可以將能量供體和受體拉到足夠近的距離，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移。由于受體的發(fā)射光來自于能量轉(zhuǎn)移，所以實(shí)驗(yàn)中不需要將未結(jié)合與已結(jié)合的分子分開，即不需要洗滌步驟，大大減少了實(shí)驗(yàn)操作步驟。

圖2

HTRF技術(shù)同時(shí)應(yīng)用了以上兩種技術(shù)原理。能量供體選擇鑭系元素銪(Eu)和鋱(Tb)的穴狀化合物，在這個(gè)穴狀化合物里，Eu或Tb被永久地嵌合在1個(gè)籠子里，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，對溫度、pH、金屬離子、螯合物等耐受性極強(qiáng)。HTRF的能量受體有2種，交聯(lián)別藻藍(lán)蛋白(cross-linked APC，商品名XL665)和小分子熒光探針d2，它們的光學(xué)性質(zhì)相同，相對分子質(zhì)量不同。前者相對分子質(zhì)量為1.05×10⁵，實(shí)際上就是改良過的別藻藍(lán)蛋白(APC)。后者相對分子質(zhì)量較小，約為1×10³，可減少空間位阻對實(shí)驗(yàn)的可能影響, 因此應(yīng)用更廣泛。HTRF 測定法通過將一個(gè)供體熒光素（長壽命熒光）或一個(gè)受體熒光素（短壽命熒光）各自耦合到兩個(gè)生物分子上從而來評估這兩個(gè)生物分子的相互作用。當(dāng)這兩個(gè)生物分子靠得足夠近時(shí)，通過運(yùn)用320nm光源激發(fā)供體熒光素后，便能測得兩種熒光染料之間的能量轉(zhuǎn)移，并且受體熒光素的665nm熒光強(qiáng)度與相互作用的生物分子數(shù)量成正比。而將此技術(shù)運(yùn)用在雙抗上時(shí)，我們會使供體熒光素和受體熒光素各自與其中一種抗原蛋白相結(jié)合。當(dāng)在檢測體系中存在可以同時(shí)結(jié)合這兩種抗原蛋白的雙抗時(shí)，便能夠?qū)⑦@兩種抗原蛋白聚集到一起，并在激發(fā)下形成能量共振轉(zhuǎn)移，且FRET信號與待測物濃度成正比（圖3）。在檢測時(shí)，通過延緩檢測時(shí)間，讓短壽命的熒光衰變掉后，再檢測熒光強(qiáng)度，消除背景熒光的干擾。同時(shí)HTRF 技術(shù)在均相（溶液）中一步反應(yīng)，無需包被、封閉、洗滌等繁瑣的操作步驟。因此該技術(shù)具有背景低、特異性好、操作簡單、體系穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

圖3

Use of HTRF products

「HTRF」產(chǎn)品怎么使用？

操作

Advantages of HTRF

「HTRF」技術(shù)好在哪？

優(yōu)勢

1??靈敏度高，線性范圍寬；

2??步驟簡單：無需包被和洗板，無需避光，適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，只需將細(xì)胞進(jìn)行刺激→裂解→加檢測試劑→讀板；

3??降低背景和提高信噪比，提高靈敏度，數(shù)據(jù)真實(shí)可靠；

4??實(shí)驗(yàn)通量高：支持96孔板、384孔板、1536孔板分析檢測；

5??實(shí)驗(yàn)體系穩(wěn)定：可耐受較寬的pH范圍、二價(jià)金屬離子、螯合物等，并可多次讀值。

Applications of HTRF

「HTRF」技術(shù)有哪些用處？

應(yīng)用

HTRF技術(shù)常被廣泛用于檢測可分析生物化學(xué)過程中的分子相互作用：

??激酶、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

??蛋白相互作用PPI(protein-protein interaction，PPI)

??DNA與蛋白的相互作用

??細(xì)胞毒性

??受體與配體的結(jié)合

其中，供體和受體可以被用于標(biāo)記各種生物分子，應(yīng)用范圍包括表觀遺傳學(xué)、生物標(biāo)志物定量、GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。特別是該檢測技術(shù)支持強(qiáng)大的混合-讀數(shù)模式，無需進(jìn)行任何清洗步驟。這一優(yōu)點(diǎn)連同實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，使該技術(shù)非常適用于自動化和篩選類應(yīng)用。

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產(chǎn)品

瑞孚迪HTRF技術(shù)無需洗滌、操作簡單、信號穩(wěn)定、靈敏度高、易于自動化等優(yōu)勢使其成為研究藥物靶標(biāo)的理想的平臺，被廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)的不同階段，從實(shí)驗(yàn)開發(fā)、藥物篩選到后期驗(yàn)證。涉及的研究模型和靶點(diǎn)包括：GPCRs、激酶、表觀遺傳、蛋白互作、信號通路研究、細(xì)胞因子檢測等。更多信息，歡迎咨詢~

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