數(shù)字PCR是一種先進核酸的分子檢測技術，通過將包含樣本的反應體系分割成多個微小的反應單元，并在每個反應單元中進行獨立的PCR擴增，最終通過統(tǒng)計每個反應單元中核酸擴增情況，通過泊松分布計算，得到投入反應體系中核酸模板的絕對拷貝數(shù)的值。

QX200? Droplet Digital? PCR 系統(tǒng)

然而樣本質(zhì)量的優(yōu)劣對最終結(jié)果有直接影響，如果分析前的標本質(zhì)量沒有保障，那么不論分析時的質(zhì)量如何，都將得不到可靠的檢測結(jié)果。在此我們對數(shù)字PCR實驗中常見的樣本要求做一個梳理，以便大家能更加順利的完成實驗。

保證實驗所需樣本達到檢測技術要求。

適用于微滴式數(shù)字PCR平臺。

1、血液樣本：

適用項目：基因表達檢測、基因突變檢測、病原檢測。

1??抽提RNA

• 用EDTA抗凝管抽取足量全血（一般至少3mL）；顛倒混勻抗凝管8-10次，充分混勻EDTA和全血，保證抗凝效果。

• 血液收集后最好保存在2-8℃。若mRNA完整性非常關鍵，血液樣品在2-8℃放置時間不要超過2小時。

• 血液在凍藏/解凍過程中會引起細胞破裂，最好避免凍藏。
  

2??抽提DNA

• 用EDTA抗凝管抽取足量全血（一般至少3mL）；顛倒混勻抗凝管8-10次，充分混勻EDTA和全血，保證抗凝效果。

• -80℃ 冰箱中保存（可保存3～5年在規(guī)定保存時間內(nèi)DNA降解幅度逐漸加大）。

• 運輸時需要準備質(zhì)地較厚的泡沫盒與充足的顆粒狀干冰且務必使采血管被干冰覆蓋。

2、血漿/胸水樣本：

適用項目：基因突變檢測、拷貝數(shù)變異檢測、基因表達檢測、miRNA定量檢測。

• 5-6mL全血/胸水樣本于采集后2小時內(nèi)進行離心分離血漿/上清，1600g，4℃離心10min，分離上層血漿/上清后，16000g，4℃離心10min，再次分離上層血漿。

• 血漿要求2-3ml，所分離的血漿/上清，若不能立即進行后續(xù)實驗，首選-80℃冰箱凍存。若無-80℃冰箱，可選擇-20℃保存，應盡可能縮短凍存時間，盡快進行后續(xù)檢測。凍存時注意密封及標記完整，避免反復凍融。

3、福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）樣本：

適用項目：基因突變、拷貝數(shù)變異DNA檢測。

• 用干凈刀片去除多余石蠟。把樣品切成5-10μm薄片。

• FFPE樣本厚度為5-10μm，建議樣本年限2年以內(nèi)。

• 樣本量，手術標本4-6片/位點，穿刺樣本8-10片/位點。

4、細胞樣本：

適用項目：基因突變、拷貝數(shù)變異DNA檢測。

• 收集約1-4x10⁶細胞（60mm培養(yǎng)皿或T25培養(yǎng)瓶），轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中；室溫3000rpm離心5min，(貼壁細胞去胰酶)，保留沉淀；PBS輕輕吹打清洗一次；3000rpm離心5min，去上清。

• 放入-80℃冰箱中保存。

• 上述處理過的細胞需干冰運輸，需要準備質(zhì)地較厚的泡沫盒與充足的顆粒狀干冰且務必使帶有細胞的離心管被干冰覆蓋。

5、DNA/cfDNA樣本：

適用項目：基因位點突變、拷貝數(shù)變異檢測。

• DNA總量，一般要求DNA達到10ng/反應。

• 濃度≥0.6ng/ul/反應，體積≥15ul/反應。

注：以一個反應最大上樣體積8ul估算，人基因組0.6ng/ul的濃度約5ng上樣總量，基本維持某基因總拷貝數(shù)在1000拷貝左右，從而能夠滿足大多數(shù)的項目要求。受限于基因組完整度、物種基因組大小、多倍體或單倍體等復雜情況，該濃度要求不能完全代表所有情況。

6、RNA樣本：

適用項目：基因表達量檢測、融合基因檢測、AR-V7等的項目檢測。

• 濃度：≧40ng/ul，體積≥15ul/反應。

• 樣本提取產(chǎn)物純度(A260/A280)，1.5~2.4。

7、質(zhì)粒樣本：

適用項目：質(zhì)粒定量、基因突變檢測。

• 濃度：質(zhì)粒樣本須清晰標示，并標明“次方”。

• 質(zhì)粒樣本稀釋至6次方及以下濃度，送樣體積根據(jù)實驗需求送樣。

注：數(shù)字PCR的理論定量上限是10萬拷貝，故一般建議質(zhì)粒濃度不超過6次方，但受限于生產(chǎn)、運輸保存條件、引物的擴增效率等因素，估算拷貝數(shù)并不能完全評價實測情況，以實際檢測情況為準。

樣本信息及接收