數(shù)字PCR是一種先進(jìn)核酸的分子檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)將包含樣本的反應(yīng)體系分割成多個(gè)微小的反應(yīng)單元，并在每個(gè)反應(yīng)單元中進(jìn)行獨(dú)立的PCR擴(kuò)增，最終通過(guò)統(tǒng)計(jì)每個(gè)反應(yīng)單元中核酸擴(kuò)增情況，通過(guò)泊松分布計(jì)算，得到投入反應(yīng)體系中核酸模板的絕對(duì)拷貝數(shù)的值。

QX200? Droplet Digital? PCR 系統(tǒng)

然而樣本質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)最終結(jié)果有直接影響，如果分析前的標(biāo)本質(zhì)量沒(méi)有保障，那么不論分析時(shí)的質(zhì)量如何，都將得不到可靠的檢測(cè)結(jié)果。在此我們對(duì)數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的樣本要求做一個(gè)梳理，以便大家能更加順利的完成實(shí)驗(yàn)。

保證實(shí)驗(yàn)所需樣本達(dá)到檢測(cè)技術(shù)要求。

適用于微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)。

1、血液樣本：

適用項(xiàng)目：基因表達(dá)檢測(cè)、基因突變檢測(cè)、病原檢測(cè)。

1??抽提RNA

• 用EDTA抗凝管抽取足量全血（一般至少3mL）；顛倒混勻抗凝管8-10次，充分混勻EDTA和全血，保證抗凝效果。

• 血液收集后最好保存在2-8℃。若mRNA完整性非常關(guān)鍵，血液樣品在2-8℃放置時(shí)間不要超過(guò)2小時(shí)。

• 血液在凍藏/解凍過(guò)程中會(huì)引起細(xì)胞破裂，最好避免凍藏。
  

2??抽提DNA

• 用EDTA抗凝管抽取足量全血（一般至少3mL）；顛倒混勻抗凝管8-10次，充分混勻EDTA和全血，保證抗凝效果。

• -80℃ 冰箱中保存（可保存3～5年在規(guī)定保存時(shí)間內(nèi)DNA降解幅度逐漸加大）。

• 運(yùn)輸時(shí)需要準(zhǔn)備質(zhì)地較厚的泡沫盒與充足的顆粒狀干冰且務(wù)必使采血管被干冰覆蓋。

2、血漿/胸水樣本：

適用項(xiàng)目：基因突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異檢測(cè)、基因表達(dá)檢測(cè)、miRNA定量檢測(cè)。

• 5-6mL全血/胸水樣本于采集后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行離心分離血漿/上清，1600g，4℃離心10min，分離上層血漿/上清后，16000g，4℃離心10min，再次分離上層血漿。

• 血漿要求2-3ml，所分離的血漿/上清，若不能立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，首選-80℃冰箱凍存。若無(wú)-80℃冰箱，可選擇-20℃保存，應(yīng)盡可能縮短凍存時(shí)間，盡快進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。凍存時(shí)注意密封及標(biāo)記完整，避免反復(fù)凍融。

3、福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）樣本：

適用項(xiàng)目：基因突變、拷貝數(shù)變異DNA檢測(cè)。

• 用干凈刀片去除多余石蠟。把樣品切成5-10μm薄片。

• FFPE樣本厚度為5-10μm，建議樣本年限2年以內(nèi)。

• 樣本量，手術(shù)標(biāo)本4-6片/位點(diǎn)，穿刺樣本8-10片/位點(diǎn)。

4、細(xì)胞樣本：

適用項(xiàng)目：基因突變、拷貝數(shù)變異DNA檢測(cè)。

• 收集約1-4x10⁶細(xì)胞（60mm培養(yǎng)皿或T25培養(yǎng)瓶），轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中；室溫3000rpm離心5min，(貼壁細(xì)胞去胰酶)，保留沉淀；PBS輕輕吹打清洗一次；3000rpm離心5min，去上清。

• 放入-80℃冰箱中保存。

• 上述處理過(guò)的細(xì)胞需干冰運(yùn)輸，需要準(zhǔn)備質(zhì)地較厚的泡沫盒與充足的顆粒狀干冰且務(wù)必使帶有細(xì)胞的離心管被干冰覆蓋。

5、DNA/cfDNA樣本：

適用項(xiàng)目：基因位點(diǎn)突變、拷貝數(shù)變異檢測(cè)。

• DNA總量，一般要求DNA達(dá)到10ng/反應(yīng)。

• 濃度≥0.6ng/ul/反應(yīng)，體積≥15ul/反應(yīng)。

注：以一個(gè)反應(yīng)最大上樣體積8ul估算，人基因組0.6ng/ul的濃度約5ng上樣總量，基本維持某基因總拷貝數(shù)在1000拷貝左右，從而能夠滿足大多數(shù)的項(xiàng)目要求。受限于基因組完整度、物種基因組大小、多倍體或單倍體等復(fù)雜情況，該濃度要求不能完全代表所有情況。

6、RNA樣本：

適用項(xiàng)目：基因表達(dá)量檢測(cè)、融合基因檢測(cè)、AR-V7等的項(xiàng)目檢測(cè)。

• 濃度：≧40ng/ul，體積≥15ul/反應(yīng)。

• 樣本提取產(chǎn)物純度(A260/A280)，1.5~2.4。

7、質(zhì)粒樣本：

適用項(xiàng)目：質(zhì)粒定量、基因突變檢測(cè)。

• 濃度：質(zhì)粒樣本須清晰標(biāo)示，并標(biāo)明“次方”。

• 質(zhì)粒樣本稀釋至6次方及以下濃度，送樣體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求送樣。

注：數(shù)字PCR的理論定量上限是10萬(wàn)拷貝，故一般建議質(zhì)粒濃度不超過(guò)6次方，但受限于生產(chǎn)、運(yùn)輸保存條件、引物的擴(kuò)增效率等因素，估算拷貝數(shù)并不能完全評(píng)價(jià)實(shí)測(cè)情況，以實(shí)際檢測(cè)情況為準(zhǔn)。

樣本信息及接收