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生信篇 | Unicycler：混合測序時代的細(xì)菌基因組組裝利器

來源: | 作者:/ | 發(fā)布時間: 2025-02-19 | 362 次瀏覽 | 分享到:

Unicycler 是一款專為細(xì)菌基因組設(shè)計的混合組裝工具，由 Ryan Wick 博士團隊開發(fā)。它巧妙結(jié)合了二代測序中短讀長（Illumina）的高準(zhǔn)確性與三代測序中長讀長（PacBio/Oxford Nanopore）的跨重復(fù)優(yōu)勢，特別適用于高重復(fù)、高雜合或復(fù)雜結(jié)構(gòu)的微生物基因組組裝。同時，它也是一款可以獨立完成二代測序基因組組裝、三代測序基因組組裝以及二三代測序數(shù)據(jù)混合組裝的優(yōu)秀生信軟件，下文將著重介紹二三代測序數(shù)據(jù)混合組裝。

相較于傳統(tǒng)組裝工具（如SPAdes、IDBA-UD），Unicycler 在解決細(xì)菌基因組中重復(fù)序列和質(zhì)粒環(huán)狀結(jié)構(gòu)時表現(xiàn)卓越，尤其適合單菌分離樣本或宏基因組分箱后的精細(xì)化組裝。

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軟件功能亮點

1、混合組裝引擎

  • 短讀長糾錯：利用Illumina數(shù)據(jù)校正長讀長的測序錯誤，提升組裝準(zhǔn)確性。

  • 長讀長橋接：通過PacBio/Nanopore長讀長跨越重復(fù)區(qū)域，連接短讀長無法覆蓋的斷裂區(qū)域。

2、自動化流程整合

  • 內(nèi)置Bowtie2比對與Pilon糾錯，支持從原始數(shù)據(jù)到最終環(huán)化基因組的全流程自動化。

3、環(huán)狀結(jié)構(gòu)識別

  • 自動檢測染色體和質(zhì)粒的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，生成完整的閉環(huán)序列（若數(shù)據(jù)支持）。

4、靈活輸入支持

  • 兼容Illumina雙端測序、PacBio CLR/CCS及Nanopore數(shù)據(jù)，適應(yīng)不同實驗設(shè)計需求。

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算法核心解析

Unicycler 的算法設(shè)計融合了De Bruijn圖與字符串圖（String Graph）的優(yōu)勢，分三階段實現(xiàn)高效組裝：

1、短讀長糾錯與初步組裝

  • De Bruijn圖構(gòu)建：將短讀長拆分為k-mer，構(gòu)建圖結(jié)構(gòu)，通過尋找歐拉路徑生成初始Contig。

  • 錯誤剔除：基于k-mer頻率和一致性過濾低覆蓋分支，避免測序噪聲干擾。

2、長讀長進(jìn)行的圖優(yōu)化

  • 長讀長比對與糾錯：將長讀長比對至初始Contig，校正其測序錯誤并填充缺口。

  • 字符串圖構(gòu)建：基于長讀長的重疊關(guān)系構(gòu)建字符串圖，解決重復(fù)區(qū)域的路徑歧義。

3、路徑選擇與環(huán)化處理

  • 啟發(fā)式搜索最優(yōu)路徑：結(jié)合讀長覆蓋度和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)選擇最可能的路徑，生成線性或環(huán)狀Scaffold。

  • 自動環(huán)化檢測：通過比對末端重疊識別環(huán)狀結(jié)構(gòu)，輸出完整染色體/質(zhì)粒序列。

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軟件安裝

Github官網(wǎng)上有提供相應(yīng)源碼，可直接下載安裝，下面提供一種安裝方案，可以安裝最新版的Unicycler。

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實戰(zhàn)示例

案例背景：對一株耐藥性的大腸桿菌進(jìn)行基因組組裝，數(shù)據(jù)源包含illumina雙端測序（150bp）數(shù)據(jù)和Nanopore長讀長（N50=15kb）數(shù)據(jù)。

1、運行命令

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? -1/-2：illumina 雙端數(shù)據(jù)

? - l：長讀長數(shù)據(jù)

? - o：輸出目錄

2、輸出結(jié)果文件

? assembly.fasta: 最終組裝序列

? assembly.gfa: 組裝圖文件，可用Bandage軟件來可視化

? unicycler.log：詳細(xì)日志文件，可用于調(diào)試與性能評估

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結(jié)果解讀與優(yōu)化策略

1、評估指標(biāo)

  • Contig N50：若N50接近基因組預(yù)期大?。ㄈ绱竽c桿菌~4.6Mb），表明組裝連貫性高。

  • 環(huán)化比例：理想情況下，主染色體和質(zhì)粒應(yīng)標(biāo)記為環(huán)狀。

  • BUSCO完整性：使用細(xì)菌通用單拷貝基因集評估基因區(qū)域的完整性（目標(biāo)>95%）。

2、常見問題與對策

  • 碎片化Contig：增加長讀長數(shù)據(jù)中的覆蓋度或調(diào)整--min_kmer_coverage參數(shù)。

  • 環(huán)化失敗：檢查長讀長是否跨越重復(fù)區(qū)域，或手動使用Circlator等工具進(jìn)行補環(huán)。

  • 嵌合體污染：結(jié)合參考基因組比對或基于覆蓋度差異篩選異常區(qū)域進(jìn)行后續(xù)分析。

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結(jié)語

Unicycler 憑借其混合算法與自動化設(shè)計，已成為微生物基因組研究的標(biāo)桿工具。無論是臨床病原體溯源還是環(huán)境微生物挖掘，它都能提供高完整度、低錯誤率的組裝結(jié)果。下一期我們將帶來Unicycler單獨進(jìn)行二代測序數(shù)據(jù)或者三代測序數(shù)據(jù)組裝的詳細(xì)介紹，敬請期待！